Zur GMP-gerechten Archivierung von mikrobiologisch kontaminierten und mikrobiologisch potentiell kontaminierten Dokumenten
Von Anja Paul und Wolfgang Woiwode
Schlüsselwörter: Mikrobiologische Kontamination, pathogene Organismen, Archivierung, Infektionsgefahr, Quarantäne, GMP-Dokumente
Key words: Microbiological contamination, pathogenic organisms, archiving, danger of infection, quarantine, GMP-documentation
1 Einleitung
TECHPharm GmbH hatte die Aufnahme von Tätigkeiten im Sinne der §§ 44 und 49 Infektionsschutzgesetzt der zuständigen Aufsichtsbehörde, dem Regierungspräsidium Karlsruhe, Abteilung 2 Wirtschaft, Raumordnung, Bau-, Denkmal- und Gesundheitswesen, im Jahr 2008 angezeigt und unterliegt der diesbezüglichen Überwachung. Die Tätigkeiten hatten wir mit der mikrobiologischen Qualitätskontrolle von Ausgangsstoffen, Zwischenprodukten, Bulkwaren, Fertigarzneimitteln und Verpackungsmaterialien präzisiert. Sie beinhalten den Umgang mit pathogenen Vergleichsstämmen wie Escherichia coli, Salmonella enterica spp. enterica, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus spp. aureus.
Bestandteil unserer Meldung war unsere Ausarbeitung nach ICH Q9 Risikoabschätzung und Akzeptanzkriterien für die Handhabung pathogener Organismen im Rahmen mikrobiologischer Arbeiten [1]. Über unsere Ausführungen hinausgehend wurde im Verlauf der Inspektion durch das Regierungspräsidium Tübingen, Referat 24 Ärztliche und pharmazeutische Angelegenheiten, am 21.08.2008 darauf aufmerksam gemacht, dass alle Dokumente mit Aufzeichnungen aus dem mikrobiologischen Arbeitsbereich als potentiell mikrobiologisch kontaminiert einzustufen sind. Einer direkten Überstellung in das Archiv, das in unserer Firma außerhalb des Laborbereichs eingerichtet ist, wurde nicht zugestimmt. Als pragmatische Lösung wurde konzediert, diese Dokumente nach halbjähriger, kontrollierter Zwischenlagerung im mikrobiologischen Arbeitsbereich anschließend in das Archiv für die GMP-konforme Aufbewahrung zu überführen. Eine Quarantäne über 6 Monate wurde als angemessen erachtet, eine durch die Dokumente prinzipiell gegebene Infektionsgefahr zu minimieren und auszuschließen.
2 Fragestellung
In der weiteren Bearbeitung der behördlichen Vorgabe und in Wahrnehmung unserer Sorgfaltspflicht gingen wir nun der Frage nach, wie sich bekannte Populationen nach gezielter Kontamination von Papier im Verlauf der praxisüblichen Dokumentenlagerung verhalten. Dazu wurden büro- und laborübliche DIN A4 Blätter mit Suspensionen ausgewählter Typstämme kontaminiert und getrocknet. Der Verlauf der Kontamination wurde über einen Zeitraum von bis zu 12 Monaten beobachtet. Wir verwenden dafür den Begriff Archivierungsversuch.
3 Materialien und Typstämme
Die Untersuchungen erfolgten an handelsüblichem, weißen DIN A4-Papier, das in unserer Prüfeinrichtung auch in Form paginierter Rohdatenblätter für Aufzeichnungen im Verlauf der experimentellen Bearbeitung eingesetzt wird. Dieses Papier wird nachfolgend als Blatt, bzw. Blätter bezeichnet.
Die folgenden Organismen wurden verwendet:
Aspergillus niger (DSM 1957),
Bacillus subtilis (DSM 347),
Candida albicans (DSM 1386) ,
Clostridium sporogenes (DSM 795),
Escherichia coli (DSM 1103),
Pseudomonas aeruginosa (DSM 50071),
Salmonella enterica spp. enterica (DSM 17058),
Staphylococcus aureus spp. aureus (DSM 20231),
Streptococcus pyogenes (DSM 11728).
Wie nachfolgend beschrieben wurden die eingesetzten Typstämme in einer Konzentration von 102-106 KBE/ml eingesetzt, was wiederholt als Akzeptanzkriterium in den mikrobiologischen Prüfmethoden der European Pharmacopoeia [2] und der United States Pharmacopoeia [3] erwähnt wird.
4 Versuchsdurchführung
4.1 Herstellung der Stammsuspensionen
In der Reinkultur der zuvor genannten Mikroorganismen wurde die Keimzahl des jeweiligen Mikroorganismus bestimmt und je Mikroorganismus drei Zellsuspensionen mit 102, 104 und 106 KBE/ml hergestellt.
4.2 Kontamination
Je Mikroorganismus und Konzentration wurde ein definiertes Volumen der jeweiligen Zellsuspension auf die Felder eines Blattes so aufgetragen, dass eine Kontamination der benachbarten Felder eines Blattes vermieden wurde. Für jede Konzentration 102, 104 und 106 KBE/ml wurde ein eigenes Blatt angelegt. Die Blätter waren entsprechend der nachfolgenden Skizze in Felder unterteilt:
| 1. Tag – 102 Zellen |
| 1. Woche |
| 2. Woche |
| 1. Monat |
| 3. Monate |
| 6. Monate |
| 12. Monate |
| Reserve – Aspergillus niger |
| Reserve – Aspergillus niger |
Nach dem Auftragen wurden die Blätter an der Raumluft getrocknet. Danach wurde in Ordnern mit Trennblättern in der Weise abgeheftet, dass Blätter mit unterschiedlichen Mikroorganismen und unterschiedlichen Konzentrationen voneinander getrennt waren. Die Ordner wurden im mikrobiologischen Arbeitsbereich über einen Zeitraum von bis zu einem Jahr gelagert. Die Aufteilung der Blätter erlaubte es, zu jedem Prüfzeitpunkt einen Streifen (Feld) der jeweiligen Konzentration abzuschneiden. Das Ordnungsprinzip war wie folgt:- Blätter angeimpft mit sporenbildenden Mikroorganismen wie Aspergillus niger (Schimmelpilz), Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes- Blätter angeimpft mit beweglichen Mikroorganismen wie Escherichia coli, Salmonella enterica spp. enterica, Pseudomonas aeruginosa- Blätter angeimpft mit unbeweglichen Mikroorganismen wie Candida albicans (Hefe), Staphylococcus aureus spp. aureus, Streptococcus pyogenesDie komplette Untersuchung wurde zur Mittelung biologischer Bandbreiten zeitversetzt wiederholt, wie es unter 5. Ergebnisse unter Versuch1 und Versuch 2 dokumentiert ist.
4.3 Blindprobe des verwendeten handelsüblichen Papieres
Die Blätter wurden vor Einsatz im Archivierungsversuch auf eine bereits vorliegende mikrobiologische Kontamination geprüft. Dabei wurde Bacillus cereus nachgewiesen.
4.4 Lagerung
Die Lagerung der beimpften Blätter erfolgte bei Raumtemperatur im mikrobiologischen Bereich über 12 Monate. Zu den Prüfzeitpunkten 1 Tag, 1 Woche, 2 Woche, 1 Monat, 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten und 12 Monaten Lagerung wurde je Organismus und Konzentration ein Streifen (1 Feld) als Probe abgeschnitten.
4.5 Inkubation und Auswertung
Die Streifen mit Hefe- und Schimmelpilze wurden mit der beimpften Seite nach innen zusammengerollt und in je 9 ml Sabouraud-Glucose-Bouillon bis zu 10 Tage bei 20 – 25°C inkubiert. Die weiteren Streifen wurden in je 9 ml CASO-Bouillon gegeben und bei 30 – 35°C über 5 Tage inkubiert.Nach dieser Inkubation wurde jedes Bouillon-Röhrchen gut gemischt, eine geeignete Menge der jeweiligen Bakteriensuspension auf CASO-Agarplatten aufgetragen und diese weiterhin für bis zu 5 Tage bei 30 -35°C inkubiert. Die Hefe- und Schimmelpilze wurden auf Sabouraud-Glucose-Agarplatten aufgetragen und bis zu 10 Tage bei 20 – 25°C inkubiert. Die Inkubation von Clostridium sporogenes wurde anaerob durchgeführt.Wenn auf einer Agarplatte Wachstum eines Mikroorganismus erfolgte, wurde dieser nach Morphologie und mittels Keimdifferenzierung identifiziert.Weiterhin wurde je Lagerungszeitpunkt und Nährmedium eine Kontrollprobe in Form eines nicht angeimpften Papierfeldes mitgeführt.
5 Ergebnisse
Wir haben die Ergebnisse in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:
| Nicht nachweisbar nach | |||
|---|---|---|---|
| Typstamm | Konz. | Versuch 1 | Versuch 2 |
| Bacillus subtilis | 102 | 2 Wochen | 1 Woche |
| 104 | 9 Monaten | 1 Monat | |
| 106 | 3 Monaten | 1 Monat | |
| Clostridium sporogenes | 102 | 9 Monate | 6 Monate |
| 104 | 9 Monate | 6 Monate | |
| 106 | (nachweisbar 12 Monate+) | (nachweisbar 12 Monate+) | |
| Aspergillus niger | 102 | 1 Tag | 1 Tag |
| 104 | 1 Woche | 9 Monate | |
| 106 | 12 Monate | 9 Monate | |
| Streptococcus pyogenes | 102 | 1 Woche | 1 Woche |
| 104 | 1 Woche | 1 Monat | |
| 106 | 2 Wochen | 1 Monat | |
| Escherichia coli | 102 | 1 Tag | 1 Tag |
| 104 | 1 Tag | 1 Tag | |
| 106 | 2 Wochen | 1 Woche | |
| Pseudomonas aeruginosa | 102 | 1 Tag | 1 Tag |
| 104 | 1 Woche | 1 Tag | |
| 106 | 1 Woche | 1 Woche | |
| Salmonella enterica spp. enterica | 102 | 1 Tag | 1 Tag |
| 104 | 2 Wochen | 2 Wochen | |
| 106 | 1 Monat | 1 Monat | |
| Staphylococcus aureus spp. aureus |
102 | 3 Monaten | 1 Woche |
| 104 | 3 Monaten | 1 Monat | |
| 106 | 3 Monaten | 3 Monaten | |
6 Bewertung
Die Lagerung der getrockneten Blätter bei Raumtemperatur und insgesamt niedrigen relativen Luftfeuchtigkeiten unter 50 % in Verbindung mit der nicht näher bekannten Papiermatrix ist offensichtlich in der Weise abiotisch, dass sensible Stämme in kurzer Frist absterben. Erwartungsgemäß können sporenbildende Mikroorganismen längerfristig überdauern, wobei auch hier insgesamt eine Abnahme resultiert.Damit bestätigen die Ergebnisse, dass die behördliche Empfehlung angemessen ist und in Bezug auf die untersuchten pathogenen Organismen einen Sicherheitszuschlag beinhaltet.
7 Literaturverzeichnis
[1] Risikoabschätzung und Akzeptanzkriterien für die Handhabung pathogener Organismen im Rahmen mikrobiologischer Arbeiten, Ausarbeitung nach ICH Q9, TECHPharm GmbH, 2008 [2] European Pharmacopoeia (Ph.Eur.) 5.1. General Texts on Microbiology[3] United States Pharmacopoeia (USP) <1111>Microbiological attributes of nonsterile pharmaceutical products
